Fermentação e processo de extração de penicilina acilase

1.1. Penicilina acilase e suas características

Penicilina acilase, também conhecida como penicilina acilase aminohidrolase, ou penicilina acilase aminohidrolase. É obtido principalmente de enzimas intracelulares de Escherichia coli, enzimas extracelulares de Bacillus megaceus e enzimas intracelulares de Pichia pastoris. Tem sido amplamente utilizado na produção de importantes intermediários de antibióticos β-lactâmicos e antibióticos β-lactâmicos semi-sintéticos. A penicilina acilase é uma enzima que catalisa especificamente as reações da penicilina. A penicilina acilase é usada principalmente no processo de produção de ácido 6-aminopenicilânico (6-APA). O 6-APA é obtido principalmente pela desacilação da penicilina G por meio da penicilina acilase. Além disso, devido às propriedades antibacterianas, antigênicas e alergênicas da penicilina acilase, é difícil ser decomposto por enzimas em células bacterianas; além disso, devido à fácil formação de resíduos antibióticos β-lactâmicos pela penicilina acilase e ao problema da carcinogenicidade, O tratamento e o controlo de tais substâncias sempre foram um problema difícil no domínio da investigação com antibióticos.

1.2. O que é acilação?

A acilação também é chamada de acilação. Acilação refere-se à reação de introdução de acil RCO alifático-ou acil aromático ArCO-em átomos de nitrogênio, oxigênio, carbono ou enxofre em moléculas orgânicas. Os produtos após a acilação são compostos como cetonas (aldeídos), amidas e ésteres. As reações de acilação podem ser divididas em acilação de oxigênio, acilação de nitrogênio e acilação de carbono de acordo com o local da introdução de acila. Os agentes de acilação são geralmente ácidos carboxílicos ou derivados de ácido carboxílico. As reações de acilação também podem ser classificadas de acordo com o tipo de agentes acilantes.

2 Método de extração de penicilina acilase

Como reciclar e purificar a penicilina acilase, especialmente usando Escherichia coli ou Pichia pastoris para engenharia genética. Este é um elo muito importante, e este passo tem um grande impacto na qualidade da penicilina acilase.

2.1. Interrupção ultra-sônica. Cromatografia

Interrupção ultrassônica, cromatografia e purificação de extração são técnicas de biosparação comumente usadas que podem ser usadas para separar, purificar e extrair biomacromoléculas, como proteínas e ácidos nucléicos. Todo o processo é geralmente realizado a baixa temperatura (0 ~ 4 °C) para evitar a degradação e danos da amostra. Neste estudo, Escherichia coli foi usada como a principal bactéria geneticamente modificada para a extração líquida de enzimas brutas. A remoção da parede celular, ácido nucleico e partes lipídicas no extrato pode tornar a proteína alvo mais pura e estável. A fim de obter melhores resultados, o estudo adotou uma variedade de métodos de purificação eficientes, como o método de sedimentação segmentada de sulfato de amônio, método de coluna cromatográfica, DAE-método de engenharia de projeto de fibra dietética-52 cromatografia em coluna, gel material-200-hydroxyapatite cromatografia em coluna, etc. Estudos mostraram que a atividade específica da solução enzimática bruta de Escherichia coli é pobre, E geralmente quatro a cinco estágios de purificação são necessários para obter uma atividade específica mais alta. A tecnologia ultrassônica de esmagamento, cromatografia e purificação de extração pode ser efetivamente usada para purificar a solução enzimática bruta de Escherichia coli, fornecendo uma base confiável para pesquisa e aplicação funcional subsequente.

2.2. Impacto pressão osmótica

A tecnologia de pulso de alta pressão é amplamente utilizada na extração e purificação de biomacromoléculas. A penicilina acilase é uma protease intracelular distribuída principalmente na membrana celular e na parede celular, e é frequentemente usada na preparação de antibióticos. Neste estudo, a penicilina acilase foi extraída por tecnologia de pulso de alta pressão, e a solução enzimática bruta obtida teve maior atividade. Por meio da precipitação com solução aquosa de sulfato de amônio, uma taxa de reação mais alta pode ser obtida de uma só vez e pode ser aplicada diretamente à imobilização. A fim de efetivamente extrair a penicilina acilase, o estudo usou o método de choque de pressão osmótica, que é um método de extração simples e fácil que não requer muitos instrumentos e tem uma ampla gama de aplicações. Este método molha Escherichia coli em uma solução hipertônica e depois a move para um meio hipotônico. Através da ação da pressão osmótica, a parede celular se rompe e a enzima é excretada do corpo. Este método pode prevenir o problema da liberação excessiva de substâncias contidas devido à ruptura completa e manter efetivamente a taxa de sobrevivência das bactérias. Após a obtenção da enzima bruta, ela pode ser purificada por métodos como precipitação de sulfato de amônio e análise de cromatografia em coluna DEAE-cellulose-52 para obter uma enzima de eletroforese em gel de poliacrilamida com uma estrutura de banda única. É precisamente por causa deO método de impacto da pressão osmótica em que a integridade da parede celular e a taxa de sobrevivência bacteriana são mantidas durante o processo de extração, obtendo assim uma solução enzimática bruta com maior atividade específica. Além disso, este método de extração também ajuda a reter a estrutura da banda enzimática, ajudando assim a obter penicilina acilase de alta pureza e atividade específica.

2.3. Tratamento adsorvente

A penicilina acilase é uma enzima importante e tem um importante valor de aplicação na preparação de antibióticos. Neste estudo, a fim de separar a penicilina acilase do caldo de fermentação, o método de adsorção foi usado para separação. O uso de hidróxido de amônio para tratar a terra diatomácea pode extrair diretamente a penicilina acilase e operar em temperatura ambiente, com alto rendimento de atividade enzimática e boas perspectivas de aplicação industrial. Para a coleta de bactérias, o consumo de energia do método de separação centrífuga é alto devido ao pequeno tamanho dos microrganismos e à dificuldade na precipitação. Além disso, o método de floculação única não pode coletar completamente as bactérias. Portanto, uma combinação de floculantes e tecnologia de centrifugação pode ser usada para coletar bactérias para melhorar a eficiência da coleta e reduzir o consumo de energia centrífuga. Existem muitos fatores que afetam a atividade enzimática durante a produção e extração da penicilina acilase, como o tipo, concentração, temperatura, etc. de solventes. O método de ajustar a dosagem e o valor de pH da enzima extraída também é muito crítico. Normalmente, o caldo de fermentação pode ser pré-tratado para maximizar a atividade enzimática e, em seguida, o adsorbato é adicionado e a penicilina acilase é separada. Este método pode tornar a produção e separação da penicilina acilase mais eficiente e estável.

3 Processo de fermentação da penicilina acilase

3.1. Preparação de esporos

Para as cepas melhoradas de solo arenoso, a melhoria genética pode ser realizada usando meios de cultura contendo glicerol, glicose, proteína, etc. Sob as condições da temperatura de crescimento ideal de 25-26 °C e 6-8 dias, colônias únicas podem ser obtidas e a propagação inclinada pode ser realizada, E esporos inclinados podem ser obtidos após 7 dias. Esses esporos podem ser transplantados em grãos de alta qualidade ou meio de cultura sólida de arroz, e a cultura de linhagem de painço com 3 estágios de crescimento por 7 dias a 25 °C precisa adicionar mais fonte de carbono e fonte de nitrogênio orgânico para obter uma grande quantidade de hifas. Para os esporos produzidos durante o processo de fermentação, experimentos de frasco de agitação devem ser realizados para verificar a eficácia e a condição de bactérias estranhas. Além disso, durante o processo de cultivo de tanques de sementes e tanques de fermentação, uma grande quantidade de hifas precisa ser obtida adicionando fonte de carbono e fonte de nitrogênio orgânico. Processo de fermentação para a produção de penicilina Durante a fermentação da penicilina acilase, um alto teor de oxigênio dissolvido e taxa de ventilação são necessários, e a taxa de fluxo de ar é geralmente de 1:1 ~ 1:5. A velocidade de agitação precisa ser moderada, geralmente 150 ~ 200r/min. No estágio inicial da fermentação, o poder de agitação é grande, o que pode promover o crescimento das bactérias. Além disso, o controle de parâmetros como tempo e temperatura em cada estágio de fermentação também precisa ser ajustado de acordo com diferentes cepas e condições de fermentação. O tanque de fermentação é o principal elo na produção em larga escala da penicilina acilase. No tanque de fermentação, uma variedade de substâncias, como pó de bolo de amendoim, pó de farelo, xarope de milho, glicose, uréia, etc., pode ser adicionado para melhorar o estado nutricional e a taxa de crescimento das bactérias. Ao inocular, recomenda-se controlar a quantidade de inoculação do micélio entre 12% e 15% para evitar desperdício e reduzir custos. Além disso, ao manusear o líquido residual gerado durante o processo de fermentação, deve-se prestar atenção à proteção ambiental. O líquido residual pode conter uma variedade de substâncias nocivas e poluentes, que precisam ser rigorosamente tratados e descarregados.

3.2. Controle de fermentação da penicilina acilase

O processo de preparação da penicilina acilase obteve a penicilina acilase em meio de cultura adequado, temperatura, ventilação e condições de cultura de agitação. Antes da fermentação, os equipamentos e meios relevantes (principalmente fonte de carbono, fonte de nitrogênio, precursor e sal inorgânico) são desinfetados e, em seguida, o líquido da semente é conectado. Durante este período, a fim de manter uma certa temperatura e pressão, os antiespumantes são frequentemente adicionados. Se o valor do pH do líquido de fermentação for controlado por ácido e álcali, os sais de glicose e amônio devem ser adicionados intermitentemente ou continuamente para complementar a fonte de carbono e a fonte de nitrogênio, ou outros precursores líquidos devem ser adicionados para aumentarO rendimento da penicilina acilase.

3.3. Características do processo de fermentação da penicilina acilase

No processo de produção de penicilina acilase, a solução de açúcar é um de seus principais nutrientes, e o conteúdo da solução de açúcar pode afetar diretamente a produção e o rendimento da penicilina acilase. Se a taxa de adição de açúcar for muito baixa, a taxa de crescimento do micélio diminuirá, afetando assim a atividade e a produção das bactérias, enquanto uma alta proporção de açúcar fará com que a viscosidade do líquido de fermentação aumente, o número de micélio aumente e o oxigênio dissolvido diminua rapidamente, Afetando o progresso normal da fermentação. Portanto, para produzir penicilina acilase eficiente, o conteúdo da solução de açúcar precisa ser controlado com precisão. Atualmente, uma certa curva de teor de açúcar é geralmente usada, que é baseada em dados experimentais e foi otimizada e melhorada. No entanto, uma vez que as matérias-primas de cada lote de produção são diferentes e as características da variedade de cada lote são diferentes devido a diferentes germoplasmas, se apenas a mesma curva de teor de açúcar for usada para adição, alguns produtos terão rendimentos insuficientes. Portanto, como ajustar com precisão o teor de açúcar de acordo com o estado metabólico do micélio é uma das chaves para controlar o processo de produção da penicilina acilase. Diferentes curvas de teor de açúcar podem ser usadas para ajuste de acordo com o estado metabólico do micélio. Quando o número de micélio é pequeno no estágio inicial da fermentação, a taxa de adição de açúcar da solução de açúcar pode ser aumentada gradualmente para acelerar a taxa de crescimento do micélio. Ao mesmo tempo, nos estágios intermediários e tardios da fermentação, o conteúdo da solução de açúcar deve ser controlado para evitar o acúmulo excessivo de açúcar que afeta o metabolismo normal do líquido de fermentação. Além disso, a curva de teor de açúcar pode ser ajustada dinamicamente de acordo com o teor de solução de açúcar detectado em tempo real, de modo a controlar com mais precisão o teor de solução de açúcar.

4 Processo de extração de penicilina acilase

4.1. Pré-tratamento

Após a conclusão da fermentação, ela existe no caldo de fermentação Monascus na forma de uma intensidade mínima de 10 ~ 30kg/m3, que contém uma grande quantidade de íons inorgânicos com alto teor de oxigênio (Ca, Mg, Fe), micélio, meio de cultura não utilizado, células facilmente contaminadas, metabólitos de patógenos, proteínas, Etc. Seu principal objetivo é enriquecer o produto alvo e remover uma grande quantidade de impurezas para mais separação e purificação.

4.2. Filtração

O caldo de fermentação precisa ser pré-tratado antes da extração. Uma pequena quantidade de floculante (como alúmen) pode ser adicionada ao caldo de fermentação, ou o valor do pH do caldo de fermentação pode ser ajustado ao ponto isoelétrico da proteína para precipitar a proteína, E, em seguida, o líquido flutuante é bombeado para cada câmara de filtro selada do filtro através de um tambor de vácuo (usando pressão negativa como potência de filtração) ou um cartucho de filtro plano. Sob pressão de trabalho, a separação sólido-líquido é obtida através de uma membrana de filtro ou outros bolos de filtro. Como a penicilina acilase é facilmente degradada à temperatura ambiente, a temperatura do caldo de fermentação e do filtrado é inferior a 10 ° C e seu rendimento é superior a 90%.

4.3. Extração

A penicilina acilase foi isolada da penicilina acilase por extração com solvente. É um método de concentração e purificação de antibióticos de uma fase líquida (e.g. filtrado de fermentação) para outra fase líquida (e.g. solvente orgânico) em diferentes condições de pH, em diferentes estados químicos (ácido livre ou sais), em solventes que são insolúveis em água. Como existe um grupo carboxila na estrutura das moléculas da penicilina acilase e seu pKa é 2,75, o ácido livre é formado quando sua solução aquosa é acidificada a um valor de pH de cerca de 2,0. O ácido da penicilina acilase tem extremamente baixa solubilidade e boas propriedades de extração de solvente em álcoois, cetonas, éteres, ésteres, etc., para que possa ser separado e purificado do caldo de fermentação.

A penicilina acilase é transferida para um solvente orgânico sob um ambiente ácido, o valor do pH é ajustado para cerca de 2,0 e, em seguida, entra em uma fase aquosa neutra, extraída várias vezes e finalmente purificada. A penicilina acilase com um coeficiente de partição mais alto é geralmente usada. O acetato de butilo e o acetato de n-pentilo são usados principalmente na produção industrial. O pH do acetato de butilo extraído do caldo de fermentação é de 1,8 ~ 2,0, e o valor do pH do acetato de butilo extraído de novo na fase aquosa é de 6,8 ~ 7,4. Os resultados experimentais mostram que a proporção do filtrado de fermentação para a solução de acetato de butilo é de 1,5 ~ 2,1. Soluções tampão de sulfato e carbonato somos nósEd para extração de volta para evitar flutuações de pH. A proporção de caldo de fermentação para solução é de 3 ~ 4. Após múltiplas extrações e 10 concentrações, sua concentração atende basicamente às condições de cristalização, e o rendimento total de extração chega a 85%. A solução de peneiramento obtida é principalmente extração secundária, usando solução de ácido sulfúrico a 10% com um pH de 2,0 ~ 3,0, e então acetato de butilo é adicionado, cuja quantidade é de cerca de 1/3 da solução de peneiramento, e a extração traseira é geralmente realizada com solução aquosa de bicarbonato de sódio com um pH de 7,0 ~ 8,0. Durante o processo de extração primária, devido à alta concentração de proteína na filtração, um desemulsificador precisa ser adicionado. O primeiro passo é a extração, contendo proteína e adicionando PPB 0,05% ~ 0,1%.

4.4. Extração

A fim de reduzir a degradação da penicilina acilase, ela deve ser realizada a uma temperatura baixa abaixo de 10 °C. A salmoura no tanque de extração é congelada. Durante a extração, a temperatura e a acidez têm grande influência na degradação da penicilina acilase, que é um fator importante que afeta sua degradação. Muitos estudiosos realizaram muitas pesquisas sobre isso e conduziram uma discussão detalhada sobre a influência da temperatura do esgoto e da umidade de diferentes valores de pH em sua meia-vida de degradação. Os resultados mostram que a faixa de estabilidade da penicilina acilase é pH 5,0 ~ 8,0, e mostra forte estabilidade em pH 6,0, e pode ser rapidamente degradada em condições ácidas e alcalinas. Por meio do ajuste da curva, é obtida a relação entre a meia-vida de degradação da penicilina acilase em diferentes temperaturas e o valor do pH.

4.5. Cristalização

O carvão ativado é adicionado ao extrato para remover pigmentos, fontes de calor, filtrar e remover o carvão ativado. O extrato é geralmente refinado por cristalização. No acetato de butilo, uma vez que a solubilidade do sal de potássio da penicilina acilase é muito baixa, o sal de potássio da penicilina acilase cristalizará após a adição de acetato de potássio-etanol. Nesta base, o potássio é dissolvido em solução aquosa KOH através do método de recristalização, o valor do pH é ajustado para neutro, o butanol é adicionado e, finalmente, o produto puro é obtido através da destilação azeotrópica. (1) Método de cristalização direta: O extrato de acetato de butila é reagido com acetato de sódio-etanol para obter sal de sódio cristalino. O sal de potássio da penicilina acilase é obtido misturando acetato de potássio-etanol-acetato de potássio. (2) Método de destilação azeotrópica: Após a extração, é extraído com 0,5 mol/L de hidróxido de sódio e o valor do pH é ajustado para 6,4 ~ 6,8 para obter solução salina fisiológica contendo sódio. Em 16 ~ 26 °C e 0,67 ~ 1,3 kPa, 2,5 vezes o butanol é adicionado. Água e n-butanol são evaporados azeotropicamente. Cristais de íons de sódio são precipitados. Os cristais são lavados e secos para obter produtos de penicilina acilase.